一张粗糙丑陋的手绘图——测序技术的发展历史
1. 第一代测序
技术基础
第一代测序技术用的是1975年由Sanger和Coulson开创的链终止法或者是1976-1977年由Maxam和Gilbert发明的化学法（链降解)。
发明时间
1977年，Sanger测定了第一个基因组序列。这个基因组序列是噬菌体X174的，全长5375个碱基。这标志着进入了基因组学时代。人类基因组计划完成的首个人类基因组图谱就是以Sanger测序为基础的。
原理介绍
优点
准确性高(99.999%)
缺点
成本高、通量低
2. 第二代测序
代表产品
Roche公司的454、illumina公司的Solexa, Hiseq和ABI公司的Solid
优点
大幅度降低了测序成本，提高了测序速度
原理介绍
(1)illumina
illumina公司的Solexa和Hiseq是目前使用量最大的第二代测序机器，采用的都是边合成边测序的方法。测序过程分为四步：
- 构建DNA待测文库
- Flowcell
- 桥式PCR扩增与变形
- 测序
(2)Roche 454
Roche 454是第一个商业化运营的二代测序平台，主要步骤：
- 制备DNA文库
- Emulsion PCR
- 焦磷酸测序
(3)Solid
利用DNA连接酶在连接的过程中测序，主要步骤：
- 构建DNA文库
- Emulsion PCR
- 连接酶测序
3. 第三代测序技术
代表产品
PacBio公司的SMRT, Oxford Nanopore Technoloties纳米单分子测序
优点
但分子测序，测序过程无需进行PCR扩增
原理
(1)SMRT
思想：边合成边测序
(2)纳米单分子测序
基于电信号（而非以前的光信号）
设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合了分子接头。DNA碱基通过纳米孔时，电荷发生变化，影响了流过纳米孔的电流强度，每种碱基的影响幅度是不同的，所以可以将不同的碱基区分开。通过灵敏的电子设备检测这些变化从而鉴定通过的DNA碱基。
总结
公司
平台名称
测序方法
检测方法
Reads(bp)
优点
局限性
第一代
3130xL-3730xL
桑格-毛细管电泳测序法
荧光/光学
600-1000
高读长，准确度一次性达标率高，能很好处理重复序列和多聚序列
通量低；样品制备成本高，使之难以做大量的平行测序
第二代
5500xlSolid系统
连接测序法
荧光/光学
25-35
很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低
测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵
第三代
PacBio RS
实时单分子DNA测序
荧光/光学
~1000
高平均读长，比第一代的测序时间降低；不需要扩增；最长单个读长接近3000碱基
并不能高效地将DNA聚合酶加到测序阵列中；准确性一次性达标的机会低（81-83%）；DNA聚合酶在阵列中降解；总体上每个碱基测序成本高（仪器昂贵）；
第三代
GeXP遗传分析系统
复合探针锚杂交和连接技术
荧光/光学
10
在第三代中通量最高；在所有测序技术中，用于拼接一个人基因组的试剂成本最低；每个测序步骤独立，使错误的累积变得最低
低读长； 模板制备妨碍长重复序列区域测序；样品制备费事；尚无商业化供应的仪器
第三代
个人基因组测序仪（PGM）
合成测序法
以离子敏感场效应晶体管检测pH值变化
100-200
对核酸碱基的掺入可直接测定；在自然条件下进行DNA合成（不需要使用修饰过的碱基）
一步步的洗脱过程可导致错误累积；阅读高重复和同种多聚序列时有潜在困难；
参考🌹